Полимеразная цепная реакция, также известная как ПЦР, является сложной диагностической технологией, способной обнаруживать инфекционные и вирусные заболевания. Подробнее о том, чем является ПЦР-диагностика, какими преимуществами она обладает и какие этапы проведения ее включает, мы расскажем в этой статье.

В частности, ПЦР-диагностика основывается на увеличении количества конкретной ДНК-части в образце, что позволяет ее определить в микроскопических количествах. Это обеспечивает высокую точность диагностики даже в случае незначительной концентрации заболевания.

Одним из главных преимуществ ПЦР-метода является его высокая чувствительность и специфичность, которые существенно повышают точность результатов тестов. Кроме того, ПЦР-диагностика может быть использована для обнаружения нескольких заболеваний одновременно, что экономит время и средства.

Этапы проведения ПЦР-диагностики включают подготовку образцов, извлечение и очистку ДНК, смешивание ДНК с реактивами, увеличение количества ДНК в циклах и анализ полученных результатов.

Таким образом, ПЦР-диагностика является перспективной и эффективной технологией, которая значительно облегчает задачу постановки диагнозов инфекционных и вирусных заболеваний. Ее преимущества и этапы проведения делают ее достойной конкурентом традиционных методов диагностики.

Описание ПЦР-диагностики: что это такое?

Сегодня ПЦР-диагностика, которая появилась более 30 лет назад, является одним из наиболее точных способов обнаружения инфекций. В такой диагностике используется метод, основанный на принципе многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. При этом производится амплификация, то есть простое увеличение числа копий молекулы ДНК, которая присутствует только у определенного вида патогенного микроорганизма, который интересует врача. Этот процесс происходит под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) и в результате сложного процесса образуется две молекулы ДНК из одной.

Цикл процесса образования новой молекулы ДНК занимает около 3 минут, и необходимое для достоверного визуального определения количество молекул получается после тридцати-сорока циклов.

С помощью ПЦР также можно производить различные манипуляции с генетическим материалом, такие как сращивание фрагментов ДНК, ввод мутаций и т.д. Использование ПЦР возможно не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для выделения новых генов и установления отцовства.

Эта диагностика проводится в специальных лабораториях, где используется амплификационное оборудование. Существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии, где используется не только ДНК, но и фрагменты рибонуклеиновой кислоты (РНК). Некоторые из этих модификаций не требуют специального оборудования, а амплификация осуществляется при постоянной температуре.

Одна из таких модификаций - «горячий старт ПЦР», которая подразумевает предварительное прогревание пробирок с амплификационной смесью при температуре 95°С в течение 3–5 минут, чтобы исключить клонирование неспецифических ДНК-фрагментов.

Одна из популярных модификаций ПЦР - мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследования сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Поэтому, она ускоряет и удешевляет анализ, при этом увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Одним из наиболее востребованных методов анализа в клинической медицине является ПЦР-диагностика. Этот метод находит применение в самых различных сферах.

В области урогинекологии ПЦР-диагностика используется для выявления половых инфекций, характеризующихся слабой выраженностью симптомов и часто вызывающих бесплодие и невынашивание беременности у женщин. При помощи ПЦР можно выявить наличие целого «букета» инфекций, включая хламидиоз, несколько видов микоплазмы, уреаплазму, трихомониаз, гарднереллу, кандиду, гонококк и трепонему. Кроме этого, времянка и точность ПЦР-диагностики позволяют выявить генитальный герпес и вирус папилломы человека, предотвращая риск развития злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.

В неонатологии ПЦР-диагностика эффективно выявляет наличие неонатальных инфекций у плода уже в утробе матери и у новорожденных. Среди опасных заболеваний отмечаются цитомегаловирус, токсоплазмоз, вирусы краснухи и герпеса, хламидии и микоплазмы.

Пациентам, инфицированным опасными заболеваниями крови или плазмы, такими как ВИЧ, сифилис, гепатиты, также требуется ПЦР-диагностика для избежания риска переливания крови. Метод ПЦР значительно превосходит по точности серологические методы, позволяя выявлять даже инфекции, имеющие длительный инкубационный период, которые не могут быть обнаружены обычными исследованиями в первые несколько недель.

В клинике инфекционных заболеваний ПЦР-диагностика применяется для выявления различных инфекций, включая вирусы гепатита, СПИД, холеры, бруцеллеза, туляремии, дифтерии и токсоплазмоза.

В фтизиатрии и пульмонологии ПЦР-диагностика является неоценимым инструментом для выявления возбудителей атипичных форм пневмонии и хронических рецидивирующих бронхитов, таких как хламидии и микоплазмы. Этот метод также позволяет проводить видовую идентификацию возбудителя и своевременно поставить диагноз туберкулеза.

Помимо клинической медицины, ПЦР-диагностика находит применение в криминалистике, экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии и ветеринарии.

Переваги ПЦР-діагностики

Незважаючи на те, що Полімеразна Ланцюгова Реакція (ПЦР) є відносно "молодим" методом, ключове місце в медичній практиці вона займає завдяки очевидним перевагам порівняно з іншими методами аналізу:

• Пряме визначення збудника інфекції. Деякі традиційні методи, такі як імунноферментний аналіз (ІФА), виявляють лише білки-маркери, які є продуктом життєдіяльності збудників інфекції, і тому лише опосередковано вказують на присутність мікроорганізмів. Наявність специфічного участка в ДНК, виявленого за допомогою ПЦР, безпомилково або майже безпомилково вказує на присутність конкретної інфекції.
• Висока специфічність методу. Вона обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється фрагмент ДНК, який характерний лише для конкретного збудника інфекції. Специфічність виключає можливість помилкових результатів аналізу, тоді як в імунологічних методах досліджень помилки досить ймовірні через перехресну реакцію антигенів.
• Висока чутливість. Завдяки ПЦР-діагностиці можна виявити присутність навіть одиничних клітин вірусів або бактерій в організмі в тих випадках, коли звичайними методами це практично неможливо зробити. ПЦР визначає наявність всього 10-100 клітин у зразку, тоді як імунологічними та мікроскопічними тестами можна визначити наявність інфекції при кількості клітин не менше 103-105.
• Універсальність. Схожість складу всіх ДНК або РНК дає можливість застосовувати універсальні методи лабораторних досліджень, діагностуючи єдиновременно кілька збудників із одного біологічного зразка.
• Швидкість отримання результатів. Оскільки для проведення ПЦР-діагностики не потрібен посів та виділення культури збудника, то і багато часу на це не потрібно. Весь цикл - від забору біоматеріалу до отримання результатів - займає 4-5 годин.
• Діагностика латентних інфекцій. ПЦР-методом діагностуються складні форми мікроорганізмів, які зустрічаються в тих випадках, коли захворювання перебігає у прихованій формі.

Методом ПЦР можна виявити збудників інфекції не тільки в організмі людини, але й у грунті, воді, продуктах харчування.

Ограничения ПЦР-диагностики

Не смотря на то, что ПЦР-диагностика является одним из самых эффективных и популярных методов диагностики, у неё есть свои ограничения. Однако, это ограничения настолько незначительны, что не могут негативно сказаться на эффективности метода.

Ограничения метода включают следующее:

• Вероятность амплификации ДНК не только живых, но и погибших микроорганизмов.
• Возможность возникновения перекрестной реакции.
• Изменчивость микроорганизмов.

Для контроля эффективности лечения при проведении ПЦР-диагностики необходимо соблюдать определенные требования. Например, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1-2 месяца), за который происходит полное исчезновения возбудителя инфекции в организме.

Теоретически, перекрестная реакция может возникнуть, если фрагменты ДНК праймеров будут совпадать с фрагментами ДНК, присутствующими в других микроорганизмах, чей геном на данный момент еще не расшифрован.

За счёт изменчивости микроорганизмов некоторые его штаммы могут стать неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики разрабатывались для того, чтобы уменьшить риски ложноположительных результатов анализа, и включающие проверку на перекрестные реакции, а также тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР имеет несколько этапов, которые проводятся в специальной лаборатории.

Первым этапом является забор биоматериала. Эта процедура проводится с помощью стерильного оборудования и только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть различные эпителиальные соскобы, моча, мокрота, кровь, сыворотка, плазма, биологические жидкости, а также биоптаты. Запрещено попадание следов крови в материал.

Следующий этап - хранение и транспортировка биоматериала. Образцы можно хранить на комнатной температуре в течение не более 2 часов или в холодильнике на температуре 2-8°С не более 1 суток. Некоторые биоматериалы допускают замораживание на срок до 2 недель, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Если требуется транспортировка, то пробы следует помещать в специальные термоконтейнеры или термосы.

Далее производится выделение ДНК из образца методом твердофазной сорбции. Затем в микроцентрифугу добавляется амплификационная смесь, после чего пробы устанавливаются в программируемый термостат и проводится амплификация. Время проведения зависит от заданной программы и составляет 2-3 часа.

После амплификации проводится регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяется методом электрофореза и образуется светящаяся полоса при облучении ультрафиолетовым излучением. Наличие светящейся полосы в ультрафиолетовом свете свидетельствует о положительном результате.

Интерпретация результатов исследования позволяет сделать выводы о наличии или отсутствии инфекции в организме человека. Количественный результат ПЦР-анализа может помочь врачу определить степень активности заболевания и выбрать соответствующее лечение.

Диагностика методом ПЦР: какие цены на проверку инфекций?

Стоимость диагностики методом ПЦР напрямую зависит от вида изучаемой инфекции, количества анализов, а также от качества и способа тестирования. Врачебные клиники устанавливают свои цены, что может привести к различиям в стоимости одного и того же анализа в разных клиниках.

За проведение диагностики одной инфекции обычно просят от 200 до 800 рублей, но стоимость может меняться в зависимости от медицинского учреждения. Кроме того, следует учитывать, что к оплате за диагностику нередко добавляется плата за взятие биоматериала, чья стоимость составляет около 400 рублей. В следующей таблице представлены приблизительные цены на некоторые виды ПЦР-анализов в Москве:

Помимо этого, многие клиники проводят комплексную диагностику, включающую сразу несколько анализов. Так, например, клиника может предложить комплексный анализ "ПЦР-8" на 8 бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций за 1400 рублей или "ПЦР-12" на 12 половых инфекций за 3500 рублей. Такой подход к диагностике может существенно снизить затраты на проверку на инфекции, так как при прохождении анализов по отдельности цены могут быть гораздо выше.

Фото: freepik.com